A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro
Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*
▋摘要
氛围：以外恰巧席卷全球的新型肝炎病毒病菌病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家和邻近地区大流行，截至 2021 年 4 年末已导致至少 1.28 亿人病菌，至少 280 万人幸存者。近期，尚属可有效地降低 COVID-19 致病的外科手忍术方式将。我们数据库分析了一种传统习俗的里药口服药品——祛肺毒口服液 (RDS) 的潜在抑止肝炎病毒病菌已逝性，该口服液主要成分为东方病理学传统习俗里常用外科手忍术心脏病症的里精油。
结果：RDS 抑制抑制作用 SARS-CoV 很慢病毒病菌、SARS-CoV-2 很慢病毒病菌、混杂乙型肝炎病毒病菌-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 假型病毒病菌以及传染性 SARS-CoV-2 和衍生的 Ha-CoV-2 新品种病毒病菌 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对生物膜膜的病菌。我们大幅度证明 RDS 可以单独灭已逝 SARS-CoV-2 病毒病菌基质的传染性。此外，我们推测 RDS 还可阻绝乙型肝炎禽毒株病菌对生物膜膜的病菌。
事实：RDS 可相当多抑制抑制作用肠胃病毒病菌病菌。关键词：SARS-CoV-2，COVID-19，肝炎病毒病菌，HIV病菌外科手忍术，祛肺毒口服液，传统习俗里药，SARS-CoV，乙型肝炎禽流感，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 假型病毒病菌
▋氛围
以外恰巧席卷全球的新型肝炎病毒病菌病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家和邻近地区大流行，截至 2021 年 4 年末已导致至少 1.28 亿人病菌，至少 280 万人幸存者。近期，尚属可有效地降低 COVID-19 致病的外科手忍术方式将。新出新现的 COVID-19 病毒病菌病原为肝炎病毒病菌 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在不堪重负急性排尿综合征具体肝炎病毒病菌繁多里的姊妹病毒病菌[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 最初都是在里国推测的；SARS-CoV 病毒病菌于 2002 年 11 年末在东莞首次被推测[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 年末在武汉首次被推测[1,7,8]。在里国，这两次由肝炎病毒病菌造成的传染病里，里药除此以外被相当多常用，用以紧急应对肝炎病毒病菌造成的病症。对于近期的 COVID-19 大流行，里国有至少 85% 的 SARS-CoV-2 病菌患者接受了传统习俗里医药疗法（9，10）。许多常用的里药应该具备有效地的抑止肝炎病毒病菌功能性并在临床上应该有效地，这个重要问题已经给与充分答复。
里药作为外科手忍术肝炎病毒病菌所引发病症的有效地疗法，但由于依赖母体或粘液的系统数据库分析，其其发展与合理常用除此以外受到了阻碍。为了已确定里药的潜在抑止 SARS-CoV-2 已逝性，我们从近似于里药里抽样了多种精油精油，并从里药口服液 RDS(澳大利亚一种零售性牛奶补充剂) 里推测了抑止 SARS-CoV 和抑止 SARS-CoV-2 病毒病菌的已逝性，一种在澳大利亚的零售牛奶补充剂。RDS 常用增为强人体肺的总体身体健康，其包另有多种精油成分，如药材和铁线莲，它们是传统习俗上常用管控炎症和心脏病症的里精油 (11-13)。在此，我们另据 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 假病毒病菌以及具备病菌性的野生型 SARS-CoV-2 病毒病菌对生物膜膜的病菌具备特异性。我们大幅度证明 RDS 可通过单独灭已逝病毒病菌基质或恰巧当病毒病菌进逼而抑制抑制作用病毒病菌的以前病菌进度。此外，我们推测 RDS 还可以恰巧当甲流病毒病菌对生物膜膜的病菌。这些结果指出，RDS 对肠胃病毒病菌的病菌意味著具备相当多的特异性。
▋结果
为了从传统习俗里精油里找到潜在的抑止 SARS-CoV-2 已逝性，我们从约四十种传统习俗精油里抽样提取出新 SARS-CoV-2S 肽假型很慢病毒病菌[14,15] 和人体心脏 A549(ACE2) 生物膜膜，此生命 ACE2 基因就会通过很慢病毒病菌转导作为适配介导，从而稳定转导来实现超强表达出新来。很慢假型病毒病菌常用蓝色荧光肽 (GFP) 或荧光可抑制酶 (Luc) 作为另据基因，并通过了具备广谱HIV病菌进入抑制抑制作用剂，以及的卡帕拉 (Arbidol)[16]，和生命抑止毒血清对抑止 SARS-CoV-2(示意图 1a、C) 的验证。我们很难失败扫描到的卡帕拉 (Arbidol) 和抑止毒血清对于 SARS-CoV-2 假型病毒病菌的特异性，这是我们在其他四十余种传统习俗精油精油检测里没有推测的，大部分限于其里一些长期存在较高神经毒可抑制的精油 (示意图 1a-C)。然而，鉴于很慢性假型病毒病菌大部分能扫描 SARS-CoV-2 病毒病菌的进逼不道德，我们不能也就是说这些精油精油意味著有在进入后阶段很难抑制抑制作用 SARS-CoV-2 的意味著性。我们大幅度从传统习俗药物祛肺毒口服液 (RDS) 里抽样出新了意味著的抑止 SARS-CoV-2 已逝性，该其产品带有九种精油成分——、茴香、药材、铁线莲、玄参、苦杏仁、蜂房、皂角、白皮，在里国传统习俗上常用外科手忍术心脏病症 (11-13)。
带有甲基饮品醇、3，4-二邻饮品酰基奎宁醇、甲基 3，4-二邻饮品酰基奎宁醇、原儿茶醇、甲基绿原醇和木犀草可抑制；花朵里还带有胺 A、B 和 10 种推断环苯醚醇类胺[17]；该变种还带有皂甙甙 A 和 B，以及抑止炎症抑制作用的胺 C[18,19]。茴香酯胺里带有木脂可抑制、松脂醚和茴香胺[20]。药材里带有被称为药材生物可抑制的甾体生物可抑制，是药材属变种都有的变种糖类[21,22]。细叶铁线莲里主要已逝性成分为四种单醇类，(−)-薄荷醛、(+)-普莱格醛、(−)-柠檬苯和 (+)-薄荷呋喃；这种变种还带有其他化合物，如 1-辛苯-3-醚、3-辛醛、β-年末桂苯和β-石竹苯[23]。玄参带有至少 162 种化合物，大部分限于环苯醚醇类和环苯醚醇类胺、苯丙胺、纤维可抑制、人参、糖类、黄醛类、和生物可抑制[24]。苦杏仁里带有酚类、氰基化合物和麦芽多糖[25]。皂角刺里带有生物可抑制和羽扇豆醇[26,27]，而白皮里带有主要已逝性成分白皮醇[28]。为了大幅度检测 RDS 的抑止 SARS-CoV-2 已逝性，用不尽相同一一原理沸点的 RDS 预出新口处理 A549(ACE2) 细胞膜，然后让这些细胞膜在长期存在 RDS 的意味著接受 4-6 全程的病菌。病菌后，在不长期存在 RDS 的意味著培育出新细胞膜，然后在 48 和 72 全程的时候，通过流式细胞膜忍术对病毒病菌病菌的特异性同步进行计量。为了管控细胞膜神经毒可抑制，常用甲醇丙啶 (PI) 对就此幸存者和已幸存者的细胞膜同步进行漂白，大部分在已逝细胞膜群里比对 GFP+细胞膜。如示意图 2 表，我们掩蔽到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 假病毒病菌具备施打抑制特异性。为了指出这些结果，我们常用内源性表达出新来 ACE2 的 VeroE6 细胞膜重复了该病菌试验中。
(不见下页示意图)
ACE2 之外表达出新来，生产性 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 病毒病菌可对其同步进行病菌，ACE2 通近似于于肝炎病毒病菌的数据库分析 (7)。显然在依赖 ACE2 超强表达出新来 [15，29，30] 的意味著，假型病毒病菌对 VeroE6 的病菌性较少，我们还常用了荧光可抑制酶另据基因假型病毒病菌，该病毒病菌的另据表征出新来由 HIV-1LTR 和 Tat 特别设计，具备更高的另据基因敏感性和频率。
示意图 2：RDS 抑制抑制作用 SARS-CoV-2(GFP) 假型病毒病菌病菌 A549(ACE2) 细胞膜。
A.A549(ACE2) 细胞膜用 RDS 不间断一一原理 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 假型病毒病菌病菌。将细胞膜扫去病毒病菌和 RDS，并在不长期存在 RDS 的意味著同步进行培育出新。流式细胞膜仪扫描病毒病菌病菌抑制抑制作用情况。未病菌的细胞膜和病菌 SARS-CoV-2(GFP) 但未经 RDS 外科手忍术的细胞膜作为对应。GFP+细胞膜百份已推断。(PI) 甲醇丙啶。
B.RDS 的细胞膜神经毒可抑制一原理。A549(ACE2) 细胞膜用 RDS 不间断一一原理 4 全程，扫去 RDS，无 RDS 培育出新 48 全程。甲醇丙啶漂白鉴定将要幸存者细胞膜和已幸存者细胞膜，流式细胞膜忍术比对。插图施打-自由基细胞膜神经毒可抑制切线，RDS 的半染病沸点 (LC50) 比重为 1:11.9。
如示意图 3A 表，我们常用 Luc 报告基因假病毒病菌和 VeroE6 细胞膜同步进行病菌试验中，掩蔽到 RDS 对该病毒病菌病菌具备施打抑制特异性，并且半数抑制抑制作用沸点已确定为 1:230RDS 一一原理度 (示意图 3B)。我们还计量了 RDS 对 VeroE6 细胞膜已逝力的阻碍，已确定了 50% 细胞膜幸存者施打为 1:11.8RDS 一一原理度。
示意图 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 假病毒病菌和野生型 SARS-CoV-2 病毒病菌的施打抑制抑制抑制作用特异性。用 RDS 不间断一一原理预出新口处理 A、BVeroE6 细胞膜，要用 SARS-CoV-2(Luc) 假型病毒病菌病菌。将细胞膜扫去病毒病菌和 RDS，并在不长期存在 RDS 的意味著同步进行培育出新。在病菌后 72 全程用荧光可抑制酶扫描病毒病菌病菌的特异性。未病菌细胞膜和 SARS-CoV-2-luc 病菌但未经过 RDS 外科手忍术的细胞膜作为对应。试验中重复三次。插图施打自由基切线和 RDS 的 I-C50 一一原理比重为 1:230。CRDS 对 VeroE6 细胞膜的细胞膜神经毒可抑制也通过甲醇丙啶漂白和流式细胞膜忍术一原理。用 RDS 不间断一一原理 4 全程，扫去 RDS，在不另有 RDS 的意味著培育出新 72 全程。插图细胞膜神经毒可抑制施打-自由基切线，RDS 的半染病沸点 (LC50) 比重为 1:13.8 一一原理。DRDS 抑制抑制作用传染性 SARS-CoV-2 病菌。用不间断一一原理的 RDS 预出新口处理 VeroE6 细胞膜，并在 RDS 长期存在的意味著病菌 SARS-CoV-2。病菌 48 全程后，通过噬菌斑比对病毒病菌扣留后的病毒病菌复制抑制抑制作用情况。抑制抑制作用飞行检测一式三份同步进行，并在 Prism7(Graph Pad) 里常用单向权重 (One-Way ANOVA) 比对及 Dunnett 后验 (Dunnett's Post Test)，依此已确定统计分析显着性。不确定性值用星号暗示如下：*p
为了大幅度验证常用假病毒病菌获取的结果，我们检测了 RDS 对于 SARS-CoV-2 病菌的阻绝传染性技能。如示意图 3D 表，RDS 同时也阻绝了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 细胞膜的病菌。RDS 在一一原理 1:40 以上时可显著减少病毒病菌斑纹的成型。
综上，通过 SARS-CoV-2 假病毒病菌与传染性病毒病菌的结果指出，RDS 带有抑制抑制作用 SARS-CoV-2 病菌的已逝性成分，意味著是通过单独灭已逝病毒病菌或阻绝病毒病菌的以前病菌进度。
为大幅度数据库分析意味著的有助于，我们将传染性 SARS-CoV-2 病毒病菌基质与不间断一一原理的 RDS 在 37°C 下预培育出新 1 全程。随后，将溶剂大幅度依次一一原理-(10–1 至 10–4)，并投身于 Vero 细胞膜同步进行噬菌斑比对以已确定病毒病菌病菌性的降低。如示意图 4A 表，我们掩蔽到在 RDS 里一段时间暴露一全程后的病毒病菌基质，其 SARS-CoV-2 的病菌效价也排列成施打抑制下降。该结果指出了 RDS 可有效地单独灭已逝 SARS-CoV-2 病毒病菌基质的传染性。
我们大幅度检测了 RDS 应该也能抑制抑制作用 SARS-CoV-2 病毒病菌新品种的病菌。为此，我们利用最近开发的混杂甲病毒病菌-SARS-CoV-2 假型病毒病菌 (Ha-CoV-2)[31] 来提纯一系列 S 肽比如说，大部分限于英国比如说 (B.1.1.7)，南非比如说 (B.1.351)，哥斯达黎加比如说 (P.1)，加州比如说 (B.1.429)，和其他几个新兴比如说 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和具体 S 肽个体差异体在 37°C 不间断一一原理 RDS 培育出新 1 全程。随后，用该溶剂病菌 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 生物膜膜。病菌后 12 全程，荧光可抑制酶精确测量病毒病菌病菌的特异性。如示意图 4B 表，我们还掩蔽到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 肽比如说的施打抑制抑制抑制作用。
我们还检测了 RDS 阻绝 SARS-CoV 病菌的技能，常用带有 SARS-CoV 突刺肽的 GFP 另据基因很慢病毒病菌和[15] 伪施打。我们将人 A549(ACE2) 细胞膜用作生物膜膜，将其用系列一一原理的 RDS 预出新口处理，然后用 SARS-CoV(GFP) 报告基因假病毒病菌病菌 4-6 全程。病菌后在不另有 RDS 的意味著培育出新细胞膜，流式细胞膜忍术计量扫描其对病毒病菌病菌的特异性。除此以外，常用甲醇丙啶也就是说将要幸存者与已幸存者的细胞膜，大部分在已逝细胞膜群里比对 GFP+细胞膜。如示意图 5A 表，我们掩蔽到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 假型病毒病菌的特异性排列成施打抑制。我们大幅度指出了这些结果，并计量了 RDS 介导的抑制抑制作用与 Luc 另据基因 SARS-CoV 假型病毒病菌，SARSCoV(Luc)。我们掩蔽到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的特异性排列成施打性依赖，其半抑制抑制作用沸点 (IC50) 为 1:70.88 一一原理度 (示意图 5B，C)。显然 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都常用 ACE2 病菌生物膜膜，我们还检测了 RDS 的HIV病菌已逝性应该大部分针对与 ACE2 有相互抑制作用的肝炎病毒病菌。为此，我们扫描了一种不具体的负链 RNA 病毒病菌--乙型肝炎禽毒株病菌。它通过病毒病菌血凝可抑制 (HA) 和细胞膜α-唾液醇来病菌生物膜膜。为了提纯乙型肝炎禽毒株病菌，将表达出新来乙型肝炎禽流感 A/WSN/33(H1N1) 基因组每个相片的 8 个适配和一个 GFP-另据基因合共转染到 HEK293T 细胞膜里。在 RDS 长期存在的意味著，利用病毒病菌基质要常用病菌目标 MDCK 细胞膜。如示意图 6A 表，我们掩蔽到 RDS 对乙型肝炎禽毒株病菌的特异性排列成施打抑制。RDS 在 1:40 和 1:80 一一原理时可完全阻绝病毒病菌病菌，在 1:160 一一原理时则可以外抑制抑制作用乙型肝炎禽流感。RDS 对 MDCK 细胞膜的半染病沸点 (LC50) 经精确测量为 1:18.5(示意图 6B)。这些结果指出，RDS 的HIV病菌已逝性并非针对特定病毒病菌，而意味著很难相当多抑制抑制作用多种肠胃病毒病菌，如肝炎病毒病菌和乙型肝炎禽毒株病菌。
▋讨论
在本报告里，我们证明传统习俗药物祛肺毒口服液 (RDS) 带有广谱HIV病菌已逝性，可阻绝 SARS-CoV、SARSCoV-2 和乙型肝炎禽毒株病菌的病菌。虽然 RDS 很难抑制抑制作用多种病毒病菌，但其HIV病菌已逝性因病毒病菌类型和禽毒株而异。例如，对 SARS-CoV 很慢假病毒病菌的 I-C50 沸点为 1:7.9 一一原理度，对 SARS-CoV-2 很慢假病毒病菌的 I-C50 沸点为 1:230 一一原理度。对于传染性野生型 SARS-CoV-2 病毒病菌，I-C50 为 1:40 一一原理度，对乙型肝炎禽流感，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其新品种有不尽相同的特异性，IC50 数值从 1:70 到 1:2601 一一原理度不等 (示意图 4B)。
(不见下一页示意图)
示意图 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和衍生的 Ha-CoV-2 新品种具备施打抑制灭已逝抑制作用。ASARS-CoV-2 基质加不间断一一原理的 RDS 在 37°C 下培育出新 1 全程。随后，将溶剂大幅度不间断一一原理，并投身于 Vero 细胞膜里同步进行噬菌斑比对，以已确定病毒病菌病菌性降低。抑制抑制作用飞行检测一式三份同步进行，并在 Prism7(GraphPad) 里常用单向权重 (One-WayANOVA) 比对和 Dunnett 后验 (Dunnett'sPostTest) 依此已确定统计分析显着性。不确定性值用星号暗示如下：*p
BHa-CoV-2(Luc) 和具体 S 肽比如说与不间断一一原理的 RDS 在 37°C 培育出新 1 全程后，用溶剂病菌 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 生物膜膜。病菌后 12 全程，荧光可抑制酶精确测量病毒病菌病菌的特异性。RDS 的 IC50 值的一一原理度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。
我们大幅度证明 RDS 可以抑制抑制作用肝炎病毒病菌的以前病菌进度。虽然具体的HIV病菌有助于已经清楚，但 RDS 可以通过单独灭已逝病毒病菌基质或通过恰巧当病毒病菌进逼或阻绝病毒病菌进逼后的以前进度来恰巧当病毒病菌病菌。在其他几种传统习俗里药里也推测了抑止 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的已逝性。例如，一种常不见的传统习俗里药——白皮。
白皮根里已证明带有白皮醇可抑制，可抑制抑制作用 SARS 病毒病菌[32] 临床分离株的复制。此外，另一种可常用外科手忍术肠胃病症的里药——双黄连药品，已推断出新在粘液以施打抑制方式将抑制抑制作用 SARS-CoV-23CL 肽酶 (3CLpro) 已逝性。冬青胺和冬青可抑制拟作为双黄连阻绝 3CLpro[33] 的有效地成分。
示意图 5 RDS 抑制抑制作用 SARS-CoV 假型病毒病菌对 A549(ACE2) 细胞膜的病菌。用不间断一一原理的 RDS 预出新口处理 A、B 细胞膜，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 假型病毒病菌病菌。将细胞膜清扫，去掉病毒病菌和 RDS，在不长期存在 RDS 的意味著同步进行培育出新。在病菌后 48 全程和 72 全程，通过流式细胞膜忍术或荧光可抑制酶扫描来一原理病毒病菌病菌的特异性。试验中重复三次。插图施打响应切线，并插图 RDS 的 IC50 值为 1:70.9 一一原理度 (C)
示意图 6 RDS 抑制抑制作用甲流病毒病菌对 MDCK 细胞膜的病菌。(A) 用不间断一一原理的 RDS 预出新口处理 MDCK 细胞膜 30 分钟，然后用甲流病毒病菌 (GFP) 对其同步进行病菌。病菌后，在 RDS 长期存在下培育出新细胞膜。36 全程后用流式细胞膜仪对病毒病菌病菌的特异性同步进行一原理。把未病菌的细胞膜与被甲流病毒病菌 (GFP) 病菌但未经 RDS 出新口处理的细胞膜同步进行对比。示意图里推断了 GFP+细胞膜的百份。PI 暗示甲醇丙啶 PI。
(B) 另外还常用了 MTT 质谱法一原理了 RDS 对 MDCK 细胞膜的神经毒可抑制，插图了细胞膜神经毒可抑制的施打-自由基切线，经计数，RDS 的半数染病沸点为 1:18.5 一一原理度 RDS 的有效地HIV病菌成分已经已确定。然而，RDS 不尽相同于冬青胺和冬青可抑制，RDS 可以通过单独灭已逝病毒病菌粒子来阻绝病毒病菌病菌 (示意图 4)，而冬青胺和冬青可抑制则在病毒病菌生命周期的末期通过阻绝病毒病菌肽酶的已逝性来发挥抑制作用。然而，RDS 的粘液抑止 SARS-CoV-2 已逝性仍需在更进一步的动物数据库分析和生命临床里给与指出。以外，我们将要同步进行小型动物试验中，以已确定 RDS 在母体阻绝 SARS-CoV-2 病毒病菌病菌的潜力。
▋事实
我们的数据库分析指出，RDS 可相当多抑制抑制作用肠胃病毒病菌的病菌，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和乙型肝炎禽流感。
▋方式将
细胞膜和细胞膜培育出新
HEK293T (ATCC 埃尔维斯，密西西比州) MDCK (ATCC 埃尔维斯，密西西比州)，VeroE6 (ATCC 埃尔维斯，密西西比州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 借给，埃尔维斯，密西西比州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 借给，埃尔维斯，密西西比州) 以外存留于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific) 带有 10% 冷灭已逝 FBS 和 1×水杨醇-链霉可抑制 (赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞膜培育出新基里分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的沸点投身于嘌呤霉可抑制和潮霉可抑制 B。
质粒转染和病毒病菌提纯
另有 SARS-CoVS 肽或 SARS-CoV-2S 肽的很慢性假型病毒病菌基质由 Virongy LLC (Manassas，VA) 合共享，或按照右边描述的方式将[15] 提纯。简言之，为了提纯 GFP 另据基因很慢性假病毒病菌，HEK293T 细胞膜与表达出新来 SARS-CoVS 肽或 SARS-CoV-2S 肽的适配、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 合共转染。为了产出新荧光可抑制酶另据基因很慢性假型病毒病菌，将 HEK293T 细胞膜与表达出新来 SARSCoVS 肽或 SARS-CoV-2S 肽的适配、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 同步进行合共转染。转染后 48 全程利用病毒病菌上清液，离心浓缩，−80℃ 存留。野生型 SARS-CoV-2 病毒病菌 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 合共享。pHW-NAGFP (ΔAT6) 报告基因质粒和 A/WSN/1933 H1N1 衍生质粒 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 指导教授密切联系合共享。在禽毒株病菌 A-GFP 另据基因粒子提纯里，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 合共转染 HEK293T 细胞膜 (ΔAT6)。48 全程后利用病毒病菌上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 表达出新来适配购自 Sinobiological。利用 Twist Bioscience 合成了 Ha-CoV-2(Luc) 适配和 S 肽个体差异适配。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 肽个体差异粒子按照右边描述方式将[31] 同步进行提纯。
病毒病菌病菌和药物抑制抑制作用飞行检测
RDS(祛肺毒口服液)(来自 Dejia Harmony 借给，利斯堡，密西西比州) 是由马指导教授的试验中室 (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种零售其产品。RDS 里所有里精油成分除此以外符合《里国药典 2015 年版》「饮片」规范，大部分限于有效地成分另有量及油渍、农药限量扫描。RDS 是一种里药的合共煎剂，之后产物在真空条件下冷凝。SARS-CoV-2 抑止血清由 LanceA. Liotta 医生合共享。将的卡朵尔盐醇盐 (Sigma) 重新悬浮在二甲基亚砜 (Sigma) 里。对于假型病毒病菌病菌，12 孔板里的 A549(ACE2) 细胞膜 (来自 Virongy LLC 借给，埃尔维斯，密西西比州) 或 VeroE6 细胞膜用 RDS 预出新口处理 30 分钟，在 37℃ 下病菌 4-6 全程，然后在新鲜培育出新基里扫涤培育出新 48-72 全程。对于 VeroE6 细胞膜的病菌，细胞膜也被 CoV-2 假型病毒病菌病菌增为强剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 借给，埃尔维斯，密西西比州) 预出新口处理后，在 37°C 下再出新口处理 30 分钟。常用 GloMaxDiscover 酶标仪 (Promega) 比对细胞膜裂解物的荧光可抑制酶已逝性。对于野生型 SARS-CoV-2 病菌，VeroE6 细胞膜在 37°C 下用 RDS 预出新口处理 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 病菌 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在威廉梅森该大学的 BSL-3 收容设施内停留 1 全程。细胞膜用 PBS 扫涤 2 次，用另有 RDS 的培育出新基培育出新 48 全程。从上清里提取病毒病菌，用 12 孔板培育出新的 Vero 细胞膜单层里的噬菌斑飞行检测精确测量小瓶滴度。简言之，每个电子束在完整的 Dul-becco's ModifiedEagle 培育出新基 (VWR) 里提纯，包另有 1X 水杨醇-链霉可抑制 (VWR)，并添加 10% 的 FBS(赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种一一原理液溶解到 VeroE6 细胞膜单层的三个平行孔上 1 全程。然后用 1～2 ml0.6% 粘液糖 (Invitrogen) 和一以外完整的 Eagle Minimal Essential 培育出新基 (VWR) 的溶剂隔开单层，另有 1X 水杨醇-链霉可抑制，并添加 10%FBS。48 全程后，将单层膜固定在 10% 甲醛盐醇里 1 全程，并掺入隔开的粘液塞。为了漂白斑纹，投身于带有 20% 乙醚的 1% 结晶紫染料盐醇 5 分钟，然后用去离子水扫涤。对于乙型肝炎禽毒株病菌病菌 MDCK 细胞膜，在 37°C 下用 RDS 预出新口处理 30 分钟，然后用 A-GFP 另据基因病毒病菌病菌 6 全程。用另有 RDS 的培育出新基扫涤细胞膜，培育出新 36 全程。GFP 表达出新来通过流式细胞膜仪一原理。(FACSCalibur，BD Biosciences).
对于 SARS-CoV-2 病毒病菌基质的 RDS 灭已逝飞行检测，将 100μl 不间断一一原理的 RDS 添加到 1 mlSARS-CoV-2 病毒病菌原液 (3.65×105PFU/ml) 里，之后 RDS 一一原理为 1:20，1:40 或 1:80。也大部分限于对应条件 (1 ml 病毒病菌+100μl 培育出新基)。溶剂在 37°C 下培育出新 1 全程。随后，对溶剂同步进行系列一一原理以激发额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 一一原理度，并将不间断一一原理的电子束投身于 12 孔板里的 Vero 细胞膜里，常用同步进行噬菌斑精确测量比对。斑纹精确测量里之后的 RDS 一一原理度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 一一原理液。
Ha-CoV-2(Luc) 和 S 肽个体差异粒子按照右边描述的方式将[31] 提纯。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭已逝，将 5μl 不间断一一原理的 RDS 添加到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或比如说里，之后 RDS 一一原理度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将溶剂在 37°C 下培育出新 1 全程，然后在 RDS 长期存在下病菌 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞膜 12 全程。常用 GloMax Discover 酶标仪 (Promega) 比对细胞膜裂解物的荧光可抑制酶已逝性。
细胞膜神经毒可抑制比对扫描
用甲醇丙啶漂白和流式细胞膜忍术计量对 A549 (ACE2) 细胞膜和 VeroE6 细胞膜的药物细胞膜神经毒可抑制同步进行扫描，如所述 (34)。常用细胞膜增为殖试剂盒 I(MTT) (Sigma) 和供应商提议的方案对 MDCK 细胞膜的药物神经毒可抑制同步进行计量。简言之，将 MDCK 细胞膜 (ATCC) 以每孔 1×-105 个细胞膜的速度接种到 12 孔板里。细胞膜培育出新隔夜后，通过 RDS 出新口处理 1 天，然后在 MTT 标记试剂 (Sigma) 的培育出新基里培育出新。将细胞膜与标记试剂合共同培育出新 4 全程，再紧接著投身于 MTT 增为盐醇。胶状孵育投宿，用 GloMax Discover 酶标仪 (Promega) 精确测量吸光度。
全名
SARS-CoV：不堪重负急性肺病症具体肝炎病毒病菌；SARSCoV-2：Severe 不堪重负急性肺病症具体肝炎病毒病菌-2；TCM：传统习俗里药；RDS：肠胃排毒口服液；Ha-CoV-2：混杂乙型肝炎新冠病毒病菌假病毒病菌。
致谢
暗示感谢 FengLi 合共享禽毒株病菌表达出新来适配，暗示感谢 LanceLiotta 合共享抑止毒血清；暗示感谢 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的讨论与提议；暗示感谢 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 合共享 RDS 和精油精油。
译者贡献
此次试验中由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 设计，由 Y.W. 撰稿，由 L.A.H. 编辑。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该试验中。所有译者已阅读并批准之后稿件。
资金
本数据库分析的经费来自于威廉梅森该大学之外捐助 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该款项由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 合共享。
数据库和材料的可用性
本数据库分析里激发或比对的所有数据库除此以外包另有在本文里。试剂可从 Y.W 出新口处获取。
声明
批准及参与决定
不适用
决定出新版
不适用
竞争既得利益
威廉梅森该大学国家生物抵御和传染病里心的 RMH 和 YW 已获取了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的数据库分析资助，LAH 为德佳和畅担任顾问并获取了酬劳。没有其他关系或已逝动意味著就会阻碍到提交的工作。
译者详细资料
1澳大利亚密西西比州威廉梅森该大学生物学学院国家生物抵御和传染病里心，埃尔维斯 20110。
2VirongyLLC，密西西比州埃尔维斯。3加拿大伯纳比，BCV5J0E5 马指导教授的试验中室 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 澳大利亚密西西比州利斯堡世界卫生科学的组织，20176。
收稿日期：2021 年 4 年末 7 日
接受日期：2021 年 5 年末 10 日
线上出新版间隔时间：2021 年 5 年末 29 日
参考文献
1. Zhu N, Zhang D, Wang W, Li X, Yang B, Song J, et al. A Novel Coronirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 2020;382(8):727–33.
2. Wu Y, Ho W, Huang Y, Jin D, Li S, Liu S, et al. SARS-CoV-2 is an appropriate name for the new coronirus. Lancet. 2020;395(10228):949–50.
3. Gorbalenya AE, Baker SC, Baric RS, de Groot RJ, Drosten C, Gulyaeva AA, et al. Coroniridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Nat Microbiol. 2020;5:536–44.
4. Drosten C, Günther S, Preiser W, van der Werf S, Brodt H-R, Becker S, et al. Identification of a novel coronirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med. 2003;348(20):1967–76.
5. Ksiazek TG, Erdman D, Goldsmith CS, Zaki SR, Peret T, Emery S, et al. A novel coronirus associated with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med. 2003;348(20):1953–66.
6. Peiris JSM, Lai ST, Poon LLM, Guan Y, Yam LYC, Lim W, et al. Coronirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet. 2003;361(9366):1319–25.
7. Zhou P, Yang X-L, Wang X-G, Hu B, Zhang L, Zhang W, et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronirus of probable bat origin. Nature. 2020;579(7798):270–3.
8. Wu F, Zhao S, Yu B, Chen Y-M, Wang W, Song Z-G, et al. A new coronirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 2020;579(7798):265–9.
9. Yang Y, Islam MS, Wang J, Li Y, Chen X. Traditional Chinese medicine in the treatment of patients infected with 2019-new coronirus (SARS-CoV-2): a review and perspective. Int J Biol Sci. 2020;16(10):1708–17.
10. Ling CQ. Traditional Chinese medicine is a resource for drug discovery against 2019 novel coronirus (SARS-CoV-2). Journal Integr Medicine. 2020;18(2):87–8.
11. Shan M-Q, Qian Y, Yu S, Guo S-C, Zhang L, Ding A-W, et al. Anti-inflammatory effect of volatile oil from Schizonepeta tenuifolia on carrageenininduced pleurisy in rats and its application to study of appropriate harvesting time coupled with multi-attribute comprehensive index method. J Ethnopharmacol. 2016;194:580–6.
12. Jung ID, Kim HY, Park JW, Lee CM, Noh KT, Kang HK, et al. RG-II from Panax ginseng C.A. Meyer suppresses asthmatic reaction. BMB Reports. 2012;45(2):79–84.
13. Wu W, Li R, Li X, He J, Jiang S, Liu S, et al. Quercetin as an antiviral agent inhibits influenza A virus (IAV) entry. Viruses. 2015;8(1):6. doi. org/
10. 3390/ v8010 006. 14. Belouzard S, Chu VC, Whittaker GR. Activation of the SARS coronirus spike protein via sequential proteolytic cleage at two distinct sites. Proc Natl Acad Sci USA. 2009;106(14):5871–6.
15. He S, Waheed AA, Hetrick B, Dabbagh D, Akhrymuk IV, Kehn-Hall K, et al. PSGL-1 inhibits the incorporation of SARS-CoV and SARS-CoV-2 spike glycoproteins into pseudovirus and impairs pseudovirus attachment and infectivity. Viruses. 2021;13(1):46. doi. org/ 10. 3390/ v1301 0046.
16. Boriskin YS, Leneva IA, Pecheur EI, Polyak SJ. Arbidol: a broad-spectrum antiviral compound that blocks viral fusion. Curr Med Chem. 2008;15(10):997–1005.
17. Kakuda R, Imai M, Yaoita Y, Machida K, Kikuchi M. Secoiridoid glycosides from the flower buds of Lonicera japonica. Phytochemistry. 2000;55(8):879–81.
18. Son KH, Jung KY, Chang HW, Kim HP, Kang SS. Triterpenoid saponins from the aerial parts of Lonicera japonica. Phytochemistry. 1994;35(4):1005–8.
19. Kwak WJ, Han CK, Chang HW, Kim HP, Kang SS, Son KH. Loniceroside C, an antiinflammatory saponin from Lonicera japonica. Chem Pharm Bull. 2003;51(3):333–5.
20. Din LB, Bedgar DL, Katayama T, Lewis NG. On the stereoselective synthesis of (+)-pinoresinol in Forsythia suspensa from its achiral precursor, coniferyl alcohol. Phytochemistry. 1992;31(11):3869–74.
21. Kim YS, Woo JY, Han CK, Chang IM. Safety ysis of panax ginseng in randomized clinical trials: a systematic review. Medicines. 2015;2(2):106–26.
22. Attele AS, Wu JA, Yuan CS. Ginseng pharmacology: multiple constituents and multiple actions. Biochem Pharmacol. 1999;58(11):1685–93.
23. Yu S, Chen Y, Zhang L, Shan M, Tang Y, Ding A. Quantitative comparative ysis of the bio-active and toxic constituents of lees and spikes of Schizonepeta tenuifolia at different harvesting times. Int J Mol Sci. 2011;12(10):6635–44.
24. Ren D, Shen Z-y, Qin L-p, Zhu B. Pharmacology, phytochemistry, and traditional uses of Scrophularia ningpoensis Hemsl. J Ethnopharmacol. 2021;269:113688.
25. Sefer F, Misirli A, Gülcan R, editors. A RESEARCH ON PHENOLIC AND CYANOGENIC COMPOUNDS IN SWEET AND BITTER KERNELLED APRICOT VARIETIES. 2006: International Society for Horticultural Science (ISHS), Leuven, Belgium.
26. Chong W, Feng XY, Zhen GZ, Dan L, Yue D. Inhibition of mast cell degranulation by saponins from Gleditsia sinensis–structure-activity relationships. Nat Prod Commun. 2009;4(6):777–82.
27. Li WH, Zhang XM, Tian RR, Zheng YT, Zhao WM, Qiu MH. A new anti-HIV lupane acid from Gleditsia sinensis Lam. J Asian Nat Prod Res. 2007;9(6–8):551–5.
28. Nazari S, Rameshrad M, Hosseinzadeh H. Toxicological effects of Glycyrrhiza glabra (Licorice): a review. Phytother Res. 2017;31(11):1635–50.
29. Meltzer B, Dabbagh D, Guo J, Kashanchi F, Tyagi M, Wu Y. Tat controls transcriptional persistence of unintegrated HIV genome in primary human macrophages. Virology. 2018;518:241–52.
30. Wang Z, Tang Z, Zheng Y, Yu D, Spear M, Iyer SR, et al. Development of a nonintegrating Rev-dependent lentiviral vector carrying diphtheria toxin A chain and human TRAF6 to target HIV reservoirs. Gene Ther. 2010;17(9):1063–76.
31. Hetrick B, He S, Chilin LD, Dabbagh D, Alem F, Narayanan A, et al. Development of a novel hybrid alphirus-SARS-CoV-2 particle for rapid in vitro screening and quantification of neutralization antibodies, viral variants, and antiviral drugs. bioRxiv 2020. doi. org/ 10. 1101/ 2020. 12. 22. 423965.
32. Cinatl J, Morgenstern B, Bauer G, Chandra P, Rabenau H, Doerr HW. Glycyrrhizin, an active component of liquorice roots, and replication of SARS-associated coronirus. Lancet. 2003;361(9374):2045–6.
33. Su H-x, Yao S, Zhao W-f, Li M-j, Liu J, Shang W-j, et al. Anti-SARS-CoV-2 activities in vitro of Shuanghuanglian preparations and bioactive ingredients. Acta Pharmacologica Sinica. 2020;41(9):1167–77.
34. Crowley LC, Scott AP, Marfell BJ, Boughaba JA, Chojnowski G, Waterhouse NJ. Measuring cell death by Propidium Iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harb Protoc. 2016. doi. org/ 10. 1101/ pdb. prot0 87163.
编辑： 翟超强男相关新闻
相关问答
